KASP基因分型技术的结果为基因分型散点图，绿色点代表纯合1基因型、红色点代表杂合、蓝色代表纯合2、灰色是阴性对照。

图2.KASP标记的基因分型结果

表1 遗传多样性综合统计结果

Q1 KASP基因分型检测对DNA的要求是什么？​​

     浓度与体积：建议核酸样本浓度＞10ng/μL，体积＞10μL；

    纯度：粗提DNA即可，需尽量保证浓度一致。注意提取及溶解过程避免EDTA，因为EDTA会抑制KASP酶活性；

    保存：全程4℃以下保存，避免反复冻融。

Q2 KASP引物设计提交序列时的注意事项有哪些？​​

     提交序列需覆盖目标位点上下游各≥300bp序列，序列中所有多态性变异位点（SNP/InDel）需明确标注位置与类型。在引物设计过程中，确保引物序列与目标序列的互补性，尽量避免引物之间的交叉杂交和非特异性扩增。此外推荐每个位点3种基因型先进行一代测序验证，确保序列准确性。如果是通过在我司进行的项目得到的位点，则无需额外提供以上信息，我方会进行相应的处理和提取。

Q3 是否支持多对引物在同一检测板中进行检测？

     可以。但是每检测板上单对引物须满足≥22个样本，否则将影响分群判读，导致基因型错判风险增加。

Q4 NTC（无模板对照）信号值很高的原因是什么？

     可能三个方面的原因：

（1）可能是实验过程中NTC受到DNA样本的交叉污染，建议增加NTC重复数量并严格规范加样操作；

（2）循环数设置过多导致引物自身扩增，此时应优化循环参数；

（3）引物设计问题，形成引物二聚体非特异性产物，建议重新设计引物。

Q5 为什么需要进行加循环（recycling）操作？在什么情况下需要执行加循环？

     在标准36个循环的反应程序中，由于引物扩增速度和效率存在差异，部分引物可能无法在既定循环数内达到反应终点，从而导致荧光信号强度不足、数据点分群离散度较高而影响结果判读；当观察到36个循环后信号值偏低但已呈现初步分群趋势时，可在确保NTC无扩增的前提下，通过追加循环（94℃ 20秒→57℃ 60秒，3个循环）提升扩增效率，最多4次循环。

Q6 使用qPCR仪进行KASP基因分型检测的注意事项？

      与仪器适配性：根据qPCR仪型号订购合适ROX水平的Master mix；

    信号采集与分析：40℃以下读取KASP的终点荧光信号，分析数据时注意调整XY坐标轴最大最小值相当，所有数据均建议在Autocall后进行人工判读；

    设置对照：建议样品板中加入经一代验证过的阳性样品作为对照。

Q7 目标片段GC含量过高或过低有什么建议？

      针对不同GC含量片段的扩增优化建议：

  （1）高GC片段（GC%>65%）可先调整touchdown程序（标准61℃-55℃）至68℃-62℃，效果不佳，再尝试添加5%-10%Master mix体积的DMSO；

  （2）低GC片段（GC%<40%）建议先尝试将touchdown取消，改为两步法，如效果不好，再尝试加0.63%或1.06% Master mix体积的MgCl₂。

Q8 反应完成后的PCR板保存条件和保存时间建议？

      PCR反应板在反应完成后可置于4℃保存，在此条件下荧光信号可保持稳定达7天，在此期间可进行加循环操作或重复读取数据。

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