•      外源序列的插入大多呈现出随机整合的表现，而整合的随机性会导致外源基因表达的不可预测性和表型的不稳定。因此转基因成分鉴定是转基因动植物生物安全性评价的必要条件，包括外源序列的插入位点、插入序列的特征、插入位点侧翼序列等方面。

        基于全基因组重测序数据对外源片段进行检测，能够更加简单、快捷地检测外源序列的插入与否，并更加准确、直观的提供外源序列（包括目标序列，及目标序列以外的其他序列如载体骨架序列）的精确插入位点、插入方向、插入拷贝数、侧翼序列、以及插入位点与周边区域内基因功能等信息，并同时会对外源序列的一致性及重测序数据的准确性进行排查。

    分析内容

    产品优势

    测序方法

    图1.遗传转化与编辑检测

  •    

         

    外源序列同源性评估

        外源序列与野生型参考基因组的同源性进行分析，较高的同源性区域会导致reads错误比对，或者多重比对，进而影响后续对插入位点的判断。

    表1 外源序列与物种参考基因组同源性评估结果展示

    外源序列reads覆盖深度分布

    图3.组装序列与外源序列一致性评估

    注：A图为外源序列几乎无reads覆盖；B图为部分外源序列有reads覆盖；C图为整个外源序列均被reads覆盖

        对reads在外源序列上的覆盖深度（蓝色柱状）和全基因组平均测序深度（红色虚线）进行展示，从覆盖度和覆盖深度两个维度对外源序列插入的片段区域和插入的拷贝数进行直观地展示。

    图2.外源序列测序reads覆盖展示

    组装序列与外源序列一致性

        插入片段及侧翼序列组装与外源序列共线性区域，直观展示组装片段与外源插入序列的一致性，及侧翼序列位置。

    插入位点reads覆盖情况展示

        依托自主研发的全新的reads比对可视化展示工具，直观、友好地辅助展示多种外源片段插入方式、插入区域reads覆盖情况、直观展示外源序列插入的具体位置。

    图4.示例1：外源序列反向、单拷贝的插入到基因组序列中，无reads跨过插入位点

    图5.示例2：插入位点有reads跨过

    图6.示例3 部分外源序列插入且有reads跨过插入区域

    图7.示例4

        AB、CD、EF分布为genome上的三个片段，gh为外源相应位置的片段，根据测序覆盖深度，和reads比对跨越、reads覆盖深度等情况，推测转化体在该区域处的实际序列应为如下所示：AB-CD-gh-CD-gh-CD-EF，CD-gh这一单元重复的次数未知。插入区域有成对reads正常跨过，显示有部分细胞未转入成功，不含有外源序列。

    插入位点附近基因信息展示

    插入位点侧翼序列展示

        插入位点区域上下1kb涉及基因信息展示，从已有基因组基因信息方面初步了解插入造成的影响。

        直观可视化展示插入区域（红色标记）前后2,000bp的侧翼序列，便于对插入区域侧翼序列进行直接获取，以及后续引物设计验证等分析。

    图8.插入位点侧翼序列展示

  • Q1 进行外源片段检测需要的数据信息有哪些?

         （1）野生型参考基因组；

        （2）外源载体序列：仅提供目标序列仅检测目标序列的插入情况，如果提供完整载体序列，可同时检测载体骨架是否插入；

        （3）外源转入个体的全基因组重测序数据：20×

    Q2 检测结果的准确度如何？

         下述因素均会影响到检测结果，使得具体插入位点、具体插入方式评估异常：

        （1）外源片段与参考基因组的同源性，较高的同源性会影响reads比对结果；

        （2）转化实验：转化效率导致细胞中大量游离外源序列参与后续测序、外源片段自连接后插入、载体骨架插入、载体计划外断裂位置插入等影响；

        （3）测序深度：较低的测序深度会导致插入位点区域支持reads条目过少，无法精确插入位点。

    1. Doudna, J.A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 2020 578, 229–236. https://doi.org/10.1038/s41586-020-1978-5
    2. Mushtaq M, Ahmad Dar A, Skalicky M, et al. CRISPR-Based Genome Editing Tools: Insights into Technological Breakthroughs and Future Challenges. Genes (Basel). 2021;12(6):797. Published 2021 May 24. doi:10.3390/genes12060797
    3. Ahmar S, Saeed S, Khan MHU, et al. A Revolution toward Gene-Editing Technology and Its Application to Crop Improvement. Int J Mol Sci. 2020;21(16):5665. Published 2020 Aug 7. doi:10.3390/ijms21165665
    4. Sahu PK, Sao R, Mondal S, et al. Next Generation Sequencing Based Forward Genetic Approaches for Identification and Mapping of Causal Mutations in Crop Plants: A Comprehensive Review. Plants (Basel). 2020;9(10):1355. Published 2020 Oct 14. doi:10.3390/plants9101355
    5. Wang XJ, Jiao Y, Ma S, Yang JT, Wang ZX. Whole-Genome Sequencing: An Effective Strategy for Insertion Information Analysis of Foreign Genes in Transgenic Plants. Front Plant Sci. 2020 Dec 1;11:573871. doi: 10.3389/fpls.2020.573871.
    6. Itoh T, Onuki R, Tsuda M, Oshima M, Endo M, Sakai H, Tanaka T, Ohsawa R, Tabei Y. Foreign DNA detection by high-throughput sequencing to regulate genome-edited agricultural products. Sci Rep. 2020 Mar 18;10(1):4914. doi: 10.1038/s41598-020-61949-5.
    7. Kersten B, Leite Montalvão AP, Hoenicka H, Vettori C, Paffetti D, Fladung M. Sequencing of two transgenic early-flowering poplar lines confirmed vector-free single-locus T-DNA integration. Transgenic Res. 2020;29(3):321-337. doi:10.1007/s11248-020-00203-0
    8. Sun L, Ge Y, Sparks JA, et al. TDNAscan: A Software to Identify Complete and Truncated T-DNA Insertions. Front Genet. 2019;10:685. Published 2019 Jul 25. doi:10.3389/fgene.2019.00685
    9. Xu W, Zhang H, Zhang Y, et al. A paired-end whole-genome sequencing approach enables comprehensive characterization of transgene integration in rice. Commun Biol. 2022;5(1):667. Published 2022 Jul 5. doi:10.1038/s42003-022-03608-1
    10. Chen X, Dong Y, Huang Y, Fan J, Yang M, Zhang J. Whole-genome resequencing using next-generation and Nanopore sequencing for molecular characterization of T-DNA integration in transgenic poplar 741. BMC Genomics. 2021;22(1):329. Published 2021 May 6. doi:10.1186/s12864-021-07625-y
    11. Giraldo PA, Shinozuka H, Spangenberg GC, Smith KF, Cogan NOI. Rapid and Detailed Characterization of Transgene Insertion Sites in Genetically Modified Plants via Nanopore Sequencing. Front Plant Sci. 2021;11:602313. Published 2021 Feb 4. doi:10.3389/fpls.2020.602313
    12. Thomy J, Sanchez F, Gut M, et al. Combining Nanopore and Illumina Sequencing Permits Detailed Analysis of Insertion Mutations and Structural Variations Produced by PEG-Mediated Transformation in Ostreococcus tauri. Cells. 2021;10(3):664. Published 2021 Mar 17. doi:10.3390/cells10030664