项目文章丨ISPL10的表观遗传调控增强水稻品种的区域适应性

1. ispl10突变体表型

研究者通过辐射诱变得到粳稻（GJ）品种日本晴（WT）的突变体，并从中筛选到一个短日照下抽穗延迟7天、长日照下抽穗提前14天的ispl10突变体（图1）。

图1. SD和LD条件下ispl10突变体和WT的表型

2. ispl10突变基因的克隆

为了确定ispl10突变体的基因型，研究人员将其与日本晴（WT）进行回交，获得了F1代群体，F1代群体自交，获得F2代群体。F1代抽穗表型与WT相似，表明ispl10突变体的表型是由隐性基因控制的。F2代群体的抽穗日期分布呈双峰频率，且出现3:1的分离比，表明ISPL10基因是单基因控制的。ispl10与GJ品种SN265杂交，得到的F2群体用于精准定位。连锁分析将ISPL10基因定位于引物P2和P5之间的42kb区域（图2A）。该区域包含五个开放阅读框（ORF）。进一步分析发现，ispl10突变体的ORF3上存在一个7碱基的缺失，导致蛋白质结构发生改变，ORF3对应已鉴定的JMJ706基因。为了验证ISPL10的功能，构建了两个CRISPR/Cas9敲除系（T-cr1和T-cr2）（图2B）。在LD条件下，T-cr1和T-cr2与WT相比抽穗日期更早，ISPL10过表达株系抽穗日期更晚（图2C-E）。

图2. ispl10的图位克隆

3. ispl10突变体中与抽穗时间相关基因的表达

研究者首先研究了ISPL10基因在不同光照条件下的昼夜表达模式。在LD条件下，ISPL10基因的表达在中午之后开始增加，并在午夜达到峰值。在SD条件下，ISPL10基因的表达在黄昏时达到峰值，并在夜间逐渐减少。为了识别潜在的下游基因，分析了几个与抽穗日期相关的基因的表达水平。在两种光照条件下，WT和ispl10突变体的Ghd7、Hd1和Ehd1基因表达没有显著差异。在SD条件下，ispl10突变体的Hd3a基因表达显著降低。在LD条件下，ispl10突变体的Hd3a、RFT1和Ehd1基因表达显著高于野生型（图3H-J）。ISPL10似乎通过调节Ehd1的表达来部分调控FT-like基因。

图3. WT和ispl10突变体与抽穗日期相关基因表达水平的比较

4. ISPL10基因的表观调控

ISPL10/JMJ706蛋白已被报道能够特异性地逆转组蛋白H3上第9位赖氨酸的二甲基化和三甲基化。ChIP-seq分析显示，在ispl10突变体中，OsMADS51基因的四个片段上的H3K9me2水平升高（图4C）。OsMADS51位于是Ehd1的上游，其在ispl10突变体中的表达水平低于WT。结合双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）ChIP-qPCR、荧光素酶瞬时转录活性测定（LUC）实验验证OsMADS51与ISPL10之间没有互作，且ISPL10无法直接结合到OsMADS51的启动子上。结果表明ISPL10通过降低OsMADS51位点的H3K9me2甲基化水平上调其表达。OsVIL2在长日照下通过激活Ehd1促进抽穗。实验结果显示ISPL10与OsVIL2基因的启动子区域紧密结合（图4E）。OsVIL2敲除对ISPL10的表达水平没有显著影响，这表明ISPL10可能直接结合OsVIL2启动子抑制其表达。

图4. ISPL10通过OsMADS51的H3K9me2去甲基化和直接结合OsVIL2来调控抽穗时间

5. ISPL10与Se14相互作用

研究者使用了酵母双杂交（Y2H），以pGBKT7-ISPL10作为诱饵筛选到的候选蛋白中包含Se14（图5A）。Se14是含有jmjC结构域的蛋白质，在LD条件下通过去甲基化H3K4me3抑制水稻抽穗。通过共免疫沉淀和pull-down实验进一步确认了ISPL10与Se14之间的相互作用（图5B, C）。在SD和LD条件下，Se14的表达相比野生型（WT）均下调。Se14的敲除突变体（Se14-cr1和Se14-cr2）在SD条件下与WT具有相似的抽穗日期，但在LD条件下提前15天抽穗（图5D-F）。在Se14-cr1突变体中，RFT1的表达显著增加。RFT1敲除突变体的ISPL10、OsMADS51和OsVIL2表达水平与WT相比没有显著差异，表明RFT1在这些基因的下游起作用。CUT&RUN实验显示Se14-cr1突变体的RFT1染色质的II和III片段中H3K4me3水平显著高于WT，在ispl10突变体中也观察到H3K4me3水平的升高（图5H）。Y2H、BiFC、ChIP-qPCR、LUC实验验证RFT1与ISPL10之间没有互作，且ISPL10无法直接结合到RFT1的启动子上。实验结果表明ISPL10与Se14互作，通过调控RFT1位点的H3K4me2甲基化水平影响其表达。

图5. ISPL10与Se14的互作

6. ISPL10的育种应用

田间试验表明，将野生型和ispl10突变体分别种植于黑龙江、辽宁、江苏和广东时（图6A），突变体在广东抽穗延迟，在江苏、辽宁和黑龙江则显著早于野生型（图6B）。在广东，突变体因营养生长期延长实现生物量积累增加，单株产量显著提高；在江苏，生育期缩短但未造成产量损失；在辽宁和黑龙江，野生型因未能及时成熟导致结实率和千粒重下降，而突变体因抽穗提前可避免霜冻危害（图6C）。这表明ispl10突变体显著增强了水稻的区域适应性，对水稻育种具有重要意义。

图6. ispl10突变体和WT的田间试验及ISPL10的工作模型

本研究从日本晴的突变体中筛选到SD下抽穗延迟、LD下抽穗提前的ispl10突变体，通过图位克隆将目标基因锁定为ISPL10。经过大量的实验研究发现ISPL10通过三条通路调控抽穗期：（1）ISPL10通过降低OsMADS51位点的H3K9me2甲基化水平上调其表达。OsMADS51在SD条件下激活Ehd1表达，进而促进成花素基因Hd3a的表达以加速开花；（2）ISPL10直接结合OsVIL2启动子抑制其表达，进而在LD条件下抑制Ehd1，从而抑制抽穗；（3）ISPL10与JmjC家族基因Se14互作，通过调控RFT1位点的H3K4me2甲基化水平影响其表达，在LD条件抑制抽穗过程。田间试验表明，ispl10突变体在低纬度地区延长了生长期，在高纬度地区缩短了成熟期，从而提高了产量。文章的研究结果有助于我们更好地理解水稻抽穗日期的调控机制，并为水稻育种提供了新的思路。通过调控ISPL10基因的表达，可以培育出适应不同区域的水稻品种，从而提高水稻的产量和区域适应性。